材料选择对单核细胞分化成树突状细胞的重要性

2020年08月28日

基于早期在免疫疗法领域的研究和开发主要使用的是树突状细胞(DC)治疗方法。树突状细胞(DC)通常被认为在抗原呈递细胞(APC)中是功能性最强的细胞,且在连接先天性免疫系统和适应性免疫系统方面起着关键性作用[4,5]。为了以适当方式激活T细胞进行免疫攻击,树突状细胞(DC)先对抗原进行加工随后在其表面进行抗原的表达,其作用类似于公告牌。这种表达和活化的步骤经常会失去对癌细胞的识别,这就好比于当把癌细胞视为“自体”时,树突状细胞(DC)不能以适当方式处理这种信号。 

为了解决这一问题,很多研究人员已经开始研究通过培养单核细胞、分化出树突状细胞(DC)以及修饰树突状细胞(DC) 在自体外识别肿瘤信号。这样在重新回输活化的成熟树突状细胞(DC)时就会激活免疫系统(1)[6]

尽管已有多个早期和晚期临床试验使用了这种方法,但目前美国只有一种基于树突状细胞的疗法实现商业化[6]

 

1-基于树突状细胞治疗的生产[9]

Provenge®(Sipuleucel-T)2010年由Dendreon实现商业化,目前仍用于晚期前列腺癌的治疗[7]。近期市场报告预计,直到2030年“全球树突状细胞和肿瘤细胞癌疫苗”的年增长率可达20.7%[8]

随着人们越来越关注基于细胞类的药物产品,为其生产选择合适的系统和材料变得越来越重要。 

本文将重点介绍在选择培养容器时需要考虑的材料特性和重要因素。除此之外,在决定和开发完整的生产工艺时需要考虑上游(如扩增)和下游(如采集)的加工培养步骤以及配套材料(如培养基和细胞因子)也非常关键[10-12]

单核细胞到树突细胞培养系统的现状

使用一次性材料进行细胞培养可以追溯到20世纪60年代。最初先是从玻璃培养皿过渡到硬质塑料容器(T-Flask),现在的培养系统则为硬质材料和软塑料系统的动态混合,并且不断演化发展出各种新材料的创新 [13] 

选择细胞培养容器时需要考虑的关键材料特性- 透氧性和水蒸汽渗透性

很多因素会影响聚合物的渗透性,包括但不限于:

    渗透分子的大小/物理状态

    聚合物的形态/性质

    渗透物的溶解度/扩散率

    是否存在填料、湿度和增塑剂 

在选择封闭式培养系统时,包括水蒸汽在内的气体渗透性堪称最关键的特性。这是由于细胞需要依靠系统材料的渗透维持适当浓度的氧气(和二氧化碳)并获得足以限制蒸发的屏障 - 这些对于细胞的整体代谢功能至关重要。 

细胞培养通常需要使用加湿型培养箱减少细胞环境中的水分流失(2-4)

2-细胞呼吸的高水平反应[14-16]

3- 细胞呼吸的高水平反应

4- 静态渗透性培养系统

透明度

透明度是一种用于描述光线透射材料能力的物理属性。“光线”根据波长的不同可以分为紫外线、可见光以及红外光谱等。

特定波长透明度的优势与相应应用有关。包括但不限于以下一些示例:

可见光透明度(400-700nm)

    光学显微镜成像

    培养状态的目测检查(如,污染情况或pH变化)

    荧光显微镜成像

UV-A透光性(320-400nm)

    光分离置换

    荧光显微镜成像

在上述操作中,透明的培养袋能够避免进行取样或更换器皿,其不但可以减少工作量以及培养环境操控,还可消除可能的污染。

可提取物和浸出物

可提取和浸出物是用于描述各种条件下迁移化合物的术语。

可提取物物

可在标准条件下从接触表面迁移的有机和无机化学物质。标准条件可能包括:

    较高温度

    较长接触时间

    标准溶剂

可提取物在储存和使用条件下可以浸入产品中[17]

浸出物

在特定应用或“工况”条件下从接触表面迁移的有机和无机化学物质[17]

 

这些通常被视为可提取物的一种,但并非所有浸出物均要通过典型的提取测试进行识别(5)

5-可提取物与浸出物之间的关系。

由于浸出物与特定过程直接相关,因此不存在可供识别的通用测试。大多数情况下,采用多种溶剂的溶出测试以及足够灵敏的分析工具可以用于表达迁移出的化合物。一些最常用的方法如表1所示.

1- 常见的可提取物和浸出物分析方法概述[17]

通常情况下,必须要能够定量识别和确认可能从塑料装置上迁移出的杂质并对细胞的生长和培养期间有潜在的风险和和负面影响的危害。Amgen 2013年检测到即使少量迁移化合物也会造成影响。当时,Amgen所研究的是聚烯烃中的常见抗氧化剂Irgafos®168对于几种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系生长的影响[18]。经过对各种方案的彻底调查之后,Amgen通过与供应商密切合作对原料中Irgafos的初始量进行优化,以此降低浸出化合物浓度,最终降低了这种不利影响[18] 

除了对细胞培养的直接影响之外,另外还存在迁移出的化合物在药物生产过程中污染下游工序的风险,尤其是在没有最终过滤工序情况下生产细胞治疗药物工序时。

 

总结

在选择细胞培养所使用的系统时,诸如渗透性、透明性和可提取物等材料特性均至关重要。除此之外,选择适当解决方案时还要考虑其他几种材料和非材料特性。这些特性包括但不限于:

    封闭系统方案

    尺寸和形状配置

    管件、端口和连接器类型

    无菌性和保质期

本报告后续章节将概要列出氟化乙烯丙烯(FEP)(一种常见培养材料)的特性以及培养数据,以便对于关键材料特性与细胞培养性能之间的关系有一个经验上的把握。 

2- FEPEVA的透氧性

氟化乙烯丙烯的具体材料特性

FEP是一种经过完全氟化的含氟聚合物,其所具备的多种固有材料特性非常适合用于包括细胞培养在内的许多细胞疗法应用。本节提供的FEP相关数据与上述细胞培养系统的关键特性一致。 

所给出的所有性能数据均基于针对5 mil(0.127mm)薄膜的测量,该厚度为FEP培养容器的常用厚度。在渗透性方面,为了确立对比参考点,还对细胞培养常用的乙烯醋酸乙烯酯(EVA)薄膜进行了测试。在此情况下,对8mil(0.203mm)薄膜进行了测量,该厚度为EVA培养容器的普通厚度。

 

透氧性

依照ASTM D3985要求使用MOCON OxTran 220 OTR分析仪在25℃和37℃条件对氧气透过率(OTR)进行测量(3) 

3- FEPEVA的水蒸汽渗透性。

FEP的透氧性可实现氧气的大量渗透,足以满足很多细胞培养过程中的代谢要求。

 

水蒸汽渗透性

依照ASTM F1249要求使用MOCON Permatran W700水蒸气分析仪对水蒸气透过率(WVTR)进行测量(3)

尽管FEP可以渗透氧气,但却能够有效阻挡水蒸气,通常无需通过加湿,避免培养箱内的大量水分流失。这些从表4中的数据中即可看出。数据显示了40°C非加湿烘箱中的六个注水FEP袋在14天内的平均水分流失情况。(4). 

4- FEP袋内的水分流失

可提取物

与大多数聚合物不同的是,FEP薄膜的挤出工艺不使用任何添加剂(如,抗氧化剂、增塑剂、加工助剂等)。作为经过完全氟化的聚合物,其具有极高的固有稳定性,且在水或其他溶剂中不会析出改性剂或其他物质。因此,可提取物通常达到或低于检测限(5)

 

5- FEP内溶出物概况摘要

 

测试结果基于两个无菌2PF-0290 VueLife®FEP袋的汇总分析。以3cm21ml萃取比在70℃条件下在水或70%乙醇/30%水(容积百分比)中萃取24小时。

 

透明度

使用PerkinElmer UV-Vis-NIR分光光度计上测量FEP光透射率。

FEP是透光性最高的塑料,透过其薄膜可以一览无余。这对于形态学特征以及通过诸如酚红等标志物展示细胞环境的剧烈变化至关重要(6)

 

6- FEP的透明度特性

 

利用FEP培养体系进行单核细胞到树突状细胞的培养和分化

方法

单核细胞富集

按照制造商的说明使用Elutra(Terumo)细胞处理系统。简而言之,将补充1HSA(CSL)HBSS(Lonza)连接至培养基系,将0.9%氯化钠(Baxter)连接至第二培养基系,将新鲜的志愿者单采血浆(Key BiologicsTN)连接到Elutra一次性试剂盒的样品输入管线上。 

Elutra分离方案根据制造商说明操作,如表7所示

7- Elutra分离方案细节

 

单核细胞培养/分化

将含有大部分单核细胞的组分以800×g离心5分钟,并完全悬浮在CellGenix GMP DC培养基中(500U/ml GM-CSF500U / ml IL-4(均为CellGenix)进行补料)。将单位为100万细胞/毫升的培养液转移至VueLife®160-C1培养袋(圣戈班的产品)。通过摇动/倒置方式将袋中的产品充分混合,然后置于标准的加湿培养箱(37℃,5CO)7天。

1357天时将袋子从培养箱中取出,在倒置显微镜下观察,并在充分混合后取出样品。 

在第1天和第3天时,补充新鲜的树突状细胞培养基以确保取样后体积没有变化。在第5天时,向培养皿补充树突状细胞培养基以及另外500ng/ml肿瘤坏死因子α(TNFα)(CellGenix)。在第7天时,停止培养并收集细胞进行分析。

树突状细胞产量按相对单核细胞起始数量的百分比计算。

 

分析

取样后立即在Nova pHOx生化分析仪上测量酸碱平衡和呼吸参数(pCO2pO2pH)

第二个样品在解冻以及在Cedex生化分析仪(Roche)上进行乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺和铵分析之前进行冷冻。在AC* T DIFF™血液分析仪Beckman Coulter上进行全血细胞计数(CBC)

细胞计数和存活率测量在ChemometecNucleoCounter-200上进行,随后在GalliosBeckmanCoulter上对样品进行流式细胞术(FACS)分析(9)

使用FlowJo软件进行补偿和分析。

 

结论

细胞活性和产量

使用FEP袋进行培养获得相当不错的产量(60),图5,左图和活力(92),图6,右图为单核细胞到树突状细胞培养的预期值[19-21] 

6- 利用VueLife培养袋进行树突状细胞分化实验的细胞产量和细胞活力